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Work Package 4 - AeroTOX


In WP4 (AeroTOX) wird ein effizientes Auslesen der aerosolinduzierten Mechanismen biologischer und TOXikologischer Effekte, die durch verschiedene Aerosolarten (SOA, Verbrennung von Biomasse und Staub) mit fortschrittlichen Expositionsmodellen induziert werden, entwickelt, optimiert und angewendet. Entscheidend für die Vorhersage über die Auswirkungen auf die Gesundheit durch Umgebungsaerosole, ist die Verwendung eines umfassenden Satzes von Zellkulturen, stummgeschalteten Zelllinien, Co-Kulturen, Gewebekulturen und in-vivo-Experimenten, die von einer molekularbiologischen und toxikologischen Wirkungsanalyse auf dem neuesten Stand der Technik begleitet werden. Durch die Entwicklung von Lungenzellkulturmodellen für Co-Kulturen mit Zellen aus anderen Organen werden die verdeckten Wirkungen über die Lunge hinaus ausgedehnt und ermöglichen eine bessere Vorhersage der Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Die Partner WIS und HMGU tragen zu diesem WP bei. Die auf Zell- und Gewebekultur basierenden Ergebnisse werden unter sorgfältiger Verwendung von in-vivo-Modellen getestet und validiert, wobei der Leitsatz für die ethische Verwendung von Tierversuchen eingehalten wird (3R-Prinzip: reduzieren, ersetzen, verfeinern).Große Einrichtungen des Helmholtz International Laboratory: WP4 wird die Einrichtungen für Tiere, die Charakteristika der Omics und die biologischen Labore des WIS sowie die toxikologischen und biologischen Labore des HMGU nutzen. Alle drei Partner werden eine neue Infrastruktur wie fortgeschrittene Elektronenmikroskopie und Bildgebung von Metaboliten und Zellmerkmalen nutzen, sobald sie im WIS verfügbar sind.

FORSCHUNGSANSÄTZE UND METHODEN IN AeroTOX

Das Ziel von WP4 besteht darin, einen tieferen Einblick in die biologischen Auswirkungen des Alterns und die atmosphärische Umwandlung anthropogener und biogener Aerosole zu erhalten. Insbesondere wird die Frage in Betracht gezogen, ob eine Toxifizierung anthropogener Emissionen bei Alterung in der Atmosphäre hinsichtlich akuter Zytotoxizität sowie genotoxischer und epigenetischer Wirkungen beobachtet wird oder nicht. Daher wird WP4 krankheitsrelevante, empfindliche und validierte in-vitro-Lungenzell- und -Gewebemodelle sowie geeignete Tiermodelle zur Validierung der beobachteten Wirkungen entwickeln und anwenden.

Model type Models Biological characterization endpoints
Cell Cultures Lung (A549, BEAS2B, and alveolar
macrophages NR8383), Liver (AML-
12, mouse), Cardiocytes, Silenced
cells for specific key genes (shRNA
cells)
Toxicity: MTT, LDH, ROS, Oxidative damage, evaluation of cell death
mechanisms by flow cytometry, Gene expression: Microarray and
bioinformatics analysis (facilities will be provided at the WIS using Affymetrix
MAS5), Mitochondria: Seahorse analyzer, confocal microscopy for
mitochondrial potential
3D-Tissues MucilAir™ Human Airway Epithelia
consisting of primary epithelial cells ,
MucilAir™-HF Human Airway Epithelia
consisting of primary epithelial cells
co-cultured with Human airway
Fibroblasts (HF), 3D MucilAir
containing specific diseases
Gene expression: Microarray and bioinformatics analysis, facilities provided
at WIS using Affymetrix MAS5., Inflammation: Cytokine secretion, Protein
profiling: targeted proteomics, facilities will be provided at WIS, Histology
and morphology (facilities provided WIS)., Oxidative damage: adducts of
lipid and protein damage Epigenetic changes: DNA methylation
In vivo exposure Mice exposure for validation and
mechanistic understanding (to highly
impact aerosols, following RRR
principle)
Systemic inflammatory evaluation: Blood, broncho-alveolar lung fluid
(BALF) by image stream flow cytometry for specific inflammatory markers,
Gene expression: Microarray and bioinformatics analysis (facilities: WIS)
using Affymetrix MAS5), Oxidative damage: adducts of lipid and protein
damage, Epigenetic changes: DNA methylation
Histology and morphology: (facilities will be provided at WIS)
=> All in vivo experiment will be approved by the Weizmann
 Institute Animal Care and Use Committees (IACUC)

Durch gezielte toxikologische/omics-Methoden sowie durch die Entwicklung einfacherer biologischer Assays ist eine routinemäßige toxikologische Überwachung der Luftverschmutzung ein langfristiges Ziel. Die Atemwege und die Mundwege sind zusammen mit der Haut die üblichen Wege, auf denen Menschen einer Vielzahl von Umgebungsschadstoffen ausgesetzt sind. Daher werden wir die Auswirkungen der Exposition auf menschliche Lungen-, Leber- (für ein sekundäres Expositionsorgan) und Hautzellen (Epidermis) untersuchen. Im Anschluss an die Exposition (Air-Liquid-Interface (ALI) oder Offline-Exposition mit Extrakten) werden die menschlichen Zellkulturen und in-vivo-Modelle einer innovativen und verfeinerten molekularbiologischen Analyse unterzogen, für eine hochsensible,  und umfassenden Hoch-Durchsatz-Detektion von schädlichen Zell- und Gewebe-Antworten. Folgende Kulturen und 3D-Gewebemodelle nach dem modernen Stand der Wissenschaft werden verwendet:

i) Anpassung der Zellkultur- und Expositionsprotokollefür verschiedene Gewebe,

ii) Entwicklung von Zellkultivierungsmodellen und Verwendung von Lungen-3D-Geweben zur besseren Beschreibung krankheitsspezifischer Endpunkte,

iii) Zellen, die für bestimmte Mechanismen stillgelegt wurden, wie die Nrf2-bezogenen Schutzpfade, und

iv) In-vivo-Exposition unter Verwendung von Mäusen zur systemischen Bewertung der Aerosolexposition.

Durch die Verwendung von Makrophagenkulturen ist bei Langzeit-Expositionen eine bessere Beschreibung der Entzündungsreaktionen  vorgesehen. Für bestimmte Endpunkte, insbesondere über die Lunge hinaus, wird das vorhandene Know-how in der Co-Kultur genutzt, um krankheitsgerichtete Co-Kultur-Modelle unter Verwendung von Lungenzellen (Alveolar- oder Bronchialepithelzellen und/oder Makrophagen für entzündliche Endpunkte) in Verbindung mit i) Hepatozyten zu erstellen (metabolische Aktivierung), ii) Fibroblasten (Fibrose-Induktion), iii) neuronale Zellen (Auswirkungen auf das neuronale System), iv) Herzschrittmacherzellen (Einfluss des kardiovaskulären Systems). 3D-Gewebemodelle ermöglichen eine realistischere Beschreibung von entzündlichen und molekularen Reaktionen, die über längere Zeit andauern. Es werden verschiedene Endpunkte (z. B. Sekretion spezifischer Interleukine, Zelllebensfähigkeit und -integrität, Gen-Screen-Analyse, Mitochondrienfunktion, Gewebehistologie und fortgeschrittene Bildgebung) durchgeführt. Für spezifische Endpunkte (wie Mitochondrienfunktion, Metabolismus und Zell-Imaging) werden der Seahorse-Analysator und die moderne konfokale Mikroskopie mit speziellen "Reportern" verwendet. Genmikroarrays und fortgeschrittene Bioinformatik werden zusätzlich zur genspezifischen Funktion unter Verwendung von Silenced-Gentechniken (shRNA) für Zellkulturen eingesetzt. Dies ist die Grundlage für die tiefenmolekularbiologischen Analysen, die erforderlich sind, um die niedrigen Konzentrationen von Umgebungsaerosolen zu bewältigen. Die ALI-Expositionssysteme werden an mehrere Setups gekoppelt, die eine kontrollierte Alterung der Aerosole (WP2) und eine umfassende chemische Analyse der Aerosolzusammensetzung (WP3) ermöglichen. Die Studie wird eine umfassende Charakterisierung biologischer Toxizitätsmechanismen in Bezug auf das Gesundheitsrisiko in Bezug auf die jeweiligen Emissionsquellen und deren Alterungsmechanismen ermöglichen.

Aerosol Toxikologie

 

Nur sorgfältig ausgewählte Biosysteme unter realistischen Expositionsbedingungen ermöglichen signifikante Ergebnisse:

 

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